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Scientific Reports volume 13、記事番号: 12619 (2023) この記事を引用

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抗菌薬耐性と闘うための 1 つの戦略は、新しい種類の抗生物質の発見です。 ほとんどの抗生物質は、ある時点で細菌の膜と相互作用して、その完全性を妨げたり、細菌の膜を通過したりします。 したがって、膜結合の解離定数 (KD) および水相と膜相の間の分配係数 (KP) を決定するための信頼性が高く効率的なツールは、抗菌ヒットを発見し最適化するための重要なツールです。 今回我々は、マイクロスケール熱泳動（MST）がトリプトファンの固有蛍光を利用し、それによって発色団標識の必要性を排除することにより、ラベルフリーのKD測定に使用できることを実証します。 原理の証明として、我々は、一連の小型環状AMPと大型単層小胞（LUV）およびスチレンマレイン酸（SMA）および第四級アンモニウムSMA（SMA-QA）によって組み立てられた2種類の脂質ナノディスクへの結合を測定する方法を使用しました。 ）。 測定された KD 値は、表面プラズモン共鳴 (SPR) を使用した対応する測定値とよく相関しており、黄色ブドウ球菌および大腸菌に対する試験した AMP の最小阻害濃度 (MIC) も広く反映しています。 MST は、高価なサンプル前処理、標識、および/または装置時間に依存するより高度な研究に備えて、ペプチドと脂質の相互作用やサンプル条件のマッピングを迅速かつコスト効率よく検出できる有望な方法であると結論付けています。

新しい種類の抗生物質の発見が停滞する中、抗菌ペプチド (AMP) は、迫りくる抗菌薬耐性の危機と闘うためのインスピレーションの源としてますます注目を集めています1。 AMP は抗菌活性を持つペプチドの一種ですが、いくつかの抗真菌特性や抗がん特性を持つことも知られています 2,3。 これらは通常、約 12 ～ 50 アミノ酸の短いカチオン性ペプチドであり、通常、活性に必要な残基は少なくとも 4 つあります。 これらはほとんどの生体に存在し、自然免疫防御に不可欠な天然の構成要素です5、6、7、8。 現在、抗菌特性を持つ 20,000 を超えるペプチド配列が専用の寄託機関 9、10、11、12、13 に公開されており、潜在的な治療候補のプールが提供されています。 ほとんどの AMP の抗菌作用機序は、膜二重層の完全性および/または電位を標的とするか、複数の標的と作用機序の組み合わせを持つようです。これにより、耐性の発現がより困難になり、フィットネスを維持するためのコストが高くなります。 一部の例外を除き、これは、通常明確に定義された標的を持つ従来の抗生物質とは対照的です。 AMP の 2 番目の利点は、膜活性ペプチドが細菌膜自体を破壊、透過化、または溶解することによって活性を発揮するため、膜を完全に通過する必要がないことです 14,15。

細菌膜に対する AMP 親和性は、多くの場合 2 つの方法で説明されます。1 つは解離定数 KD16 を介して説明できる結合現象としてです。 または二相系として、AMP と脂質の相互作用は、分配定数 KP17 によって特徴付けられる、脂質相と水相の間の分配として見なされます。 したがって、KD と KP は両方とも、標的細菌膜との相互作用に基づいて化合物をスクリーニングするための有用な記述子です。

脂質親和性を評価するために使用される現在の方法には、通常、いくつかの欠点があります。 より強力な結合には適用できない (NMR)18、結合に影響を与える標識が必要 (蛍光アッセイ)19、時間がかかる (NMR および SPR)20,21、大量のサンプルが必要になる (NMR)、または微調整が必​​要な場合があります。個々の化合物（SPR および ITC）ごとに 20、21。 マイクロスケール熱泳動 (MST) は、これらの欠点を持たない方法です 22。 これはシンプルですが強力なツールであり、蛍光団への結合の影響と、形成された複合体の相対的な熱泳動特性を観察することによって結合パラメータの決定を可能にします。 結合は、IR レーザーに曝露したときの複合体の蛍光強度の経時変化をモニタリングすることによって取得されます。 レーザーは、リガンド濃度の異なる一連のサンプルを加熱し、異なる温度の溶液中での相対的なギブズ エネルギーに従って分子の再分布を引き起こします (熱泳動)。 リガンド結合効果による蛍光の変化は、加熱および再冷却時にモニターされます。 この方法は、リガンド結合複合体の折り畳み、形状、溶媒和シェル、電荷、または全体のサイズの変化に敏感です。 これらの変化は、複合体の熱泳動特性だけでなく、動的および静的消光を変化させることによって、蛍光団の局所環境に影響を与える可能性があり、結合によって生じる潜在的な特性の小さな変化に対して MST を敏感にする可能性があります 23。 MST は現在、主に、さまざまな基質へのリガンドの結合 22 や重合 24 など、生体分子の相互作用を評価するために使用されています。 Yu らによる以前の MST の関連アプリケーション。 は、FITC 標識を使用して AMP の結合を評価しました 25。 MST は、W、Y、F などの固有蛍光アミノ酸を利用して、蛍光標識またはラベルフリーを使用して実行できます。多くの AMP に W がほぼ遍在しているため、W の固有蛍光を利用して AMP 結合特性を直接研究する機会が得られます。 MST のその他の重要な利点は、サンプル要件が低いこと、測定時間が短いこと、実験セットアップが簡単であることです 20,21,26。